Das liegt daran, daß die PNG-Grafik beim erneuten abspeichern mit Alpha-Kanal abgespeichert wurde. Ist der vorhanden, nimmt der Maker die Transparenzinformationen daraus und erlaubt das setzen beim Importieren nicht mehr.

Idee wäre, die editierte Datei als BMP abspeichern und dann neu importieren, da BMP keinen Alpha-Kanal unterstützt kannst du wieder die Einstellungen vornehmen. Danach die Datei wieder als PNG abspeichern, diesmal aber darauf achten ohne Alpha-Kanal abzuspeichern.